Práctica 19.IMVIC

Fundamento

Son cuatro pruebas bioquímicas.Se emplean fundamentalmente para la identificación de las Enterobacterias (bacilos Gram negativos, anaerobios facultativos con metabolismo fermentador). Dependiendo de las condiciones, las enterobacterias, pueden realizar un metabolismo aerobio (si disponen de oxígeno), realizar una respiración anaerobia (si hay nitratos u otro aceptor de electrones) y distintas fermentaciones.

-Indol
-Rojo metilo
-Voges-Proskauer
-Citrato sódico

Materiales

-Reactivos
-Bacterias
-Medios de cultivo
-Mechero bunsen
-Pipetas pasteur

INDOL

Fundamento

Se determina si la bacteria posee una enzima (triptofanasa). La triptofanasa hidroliza el triptófano  en  indol y alanina. El indol se detecta empleando un reactivo específico (Reactivo de Kovacs). El triptófano forma parte de las peptonas del medio.

Procedimiento

1.Inocular una o dos colonias en caldo triptófano o peptona e incubar 24-48h

2.Añadir 5 gotas de reactivo de Kovac y efectuar lectura:

-Banda color rosa intento; indol positiva, por tanto degrada el triptófano

-Banda de color amarilla; indol negativa, por tanto no degrada triptófano

Resultdos

-Nuestra bacteria 5 no degrada el triptófano

-Nuestra bacteria 11 tampoco degrada el triptófano, por tant, ambas son indol negativas

Rojo de metilo

Fundamento

Detecta la fermentación ácido-mixta. Se acumulan ácidos (acético, fórmico, etc.), relativamente fuertes y bajan el pH del medio hasta 4-5. Dicho cambio de pH se detecta añadiendo un indicador (rojo de metilo) al cultivo

Procedimiento

1.Suspender un inóculo en el medio de cultuvo RMVP ( Clarsks y Lubs) y mezclar por rotación

2.Incubar 48h a 35ºC

3.Añadirle 5 gotas de solución indicadora de rojo metilo

4.Efectuar la lectura:

-Color rojo en el medio, positiva a la fermentación de la glucosa por la vía ácido mixta

-Color amarillo en el medio, negativa a la fermentación de la glucosa por la vía ácido mixta

Resultado

-Tanto la bacteria 5, como la 11, han dado rojo de metilo negativo

Voges-proskauer

Fundamento

Detecta la fermentación butanodiólica. En esta  fermentación se producen menor cantidad de ácidos que en la fermentación ácido-mixta, y una gran cantidad de butanodiol. Mediante un reactivo, (alfa-naftol y KOH al 40%), se detecta la presencia de un precursor del butanodiol (acetilmetilcarbinol o acetoína). La acetoina en presencia de oxígeno se oxida a diacetilo. El diacetilo oriigina una coloración roja al reaccionar con los restos guanidínicos de algunos aminoácidos de la peptona del medio

Procedimiento

1.Suspender un inóculo en el medio de cultivo MRVP, que contiene glucosa y mezclar por rotación

2.Incubar 48h

3.Añadir 12 gotas de alfa.naftol al 5% y 4 gotas de KOH al 40%

4.Esperar 5-10 min y efectuar lectura:

-Medio color rosado, fermenta la glucosa vía butanoldiólica

-Medio color amarillo, no fermenta la glucosa vía butanoldiólica

Resultado

-Nuestras bacterias 5 y 11 gan dado resultado negativo, por tanto no fermentan la glucosa vía butanoldiólica

Citrato

Fundamento

Se determina la utilización del citrato como única fuente de carbono y energía. La prueba emplea un medio definido (Koser) con citrato como única fuente carbonada (se detecta turbidez). Alternativamente se utiliza el medio de Simmons: utiliza un medio sólido con citrato sódico y un indicador ácido-base (azul de bromotimol). En este caso se detecta la alcalinización del medio por el consumo del citrato.

Procedimiento
1.Realzar una siembra por agotamiento en el agar inclinado ( agar simmons)

2.Incubar 24h a 35ºC y realizar la lectura:

-Color azul intenso, citrato positiva

-Sin cambio de color, citrato negativa

Resultado

-Tanto la bacteria 5 como la 11 no han producido cambio de color, por tanto prueba negativa